牛布鲁氏菌的分离与鉴定

2020-01-31 作者:政策标准   |   浏览(115)

  我们对可疑布鲁氏菌病奶牛血清179份,进行布鲁氏菌病补体结合试验和试管凝集试验方法检验,179份牛血清检出67份呈强阳性反应,阳性率达37%。据了解,检出的阳性牛已全部扑杀处理。随后,我们开展了病原分离,现报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)奶牛血清179份,阳性牛的脾和淋巴结4份。(2)抗原和标准血清均购自中国兽医药品监察所和中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。(3)胰蛋白胨琼脂培养基、布鲁氏菌用琼脂培养基等均按参考文献制备。每100 ml培养基中加入放线酮10 mg,万古霉素2 500 iu和多黏菌素600 iu,杆菌肽2 500 iu。(4)实验用豚鼠购自中山大学动物研究所。(5)微量生化发酵管购自广东环凯生物科技有限公司。 1.2 血清学试验 将送检奶牛血清179份分别进行布鲁氏菌病补体结合试验和布鲁氏菌病试管凝集试验。 1.3 生物学布鲁氏菌分离 无菌采取血清检测阳性牛的脾和淋巴结剪碎呈糊状,用少许灭菌生理盐水按1∶5制成混悬液,给两只体重350~400 g的雄性豚鼠腹腔内注射,2 ml/只。接种后第21天,采血约1 ml,2 000 r/min离心15 min,取血清进行布病琥红平板凝集试验。凝集价为1∶2++++。待接种后第34天,采血检查血清抗体,凝集价达1∶5++++。 证明豚鼠已感染布鲁氏菌。随即心脏采血致死豚鼠并剖检,取心血和脏器进行分离培养细菌。 1.4 分离培养 (1)将4份阳性牛内脏脾和淋巴结接种胰蛋白胨琼脂平板、布鲁氏菌用琼脂平板各双份,一份置厌氧包37℃环境,另一份置普通37℃培养。(2)无菌取接种豚鼠的心全血和脾、淋巴结等接种胰蛋白胨琼脂平板、布鲁氏菌用琼脂培养基平板各两份,一份置厌氧包37℃环境,另一份置普通37℃培养。 1.5 形态观察 对培养出的细菌菌落进行观察,以记录其特征。将分离菌纯培养物用革兰氏染色,观察细菌形态及染色特性。 1.6 生化试验 对分离纯化的细菌分别做硫化氢产生试验、尿素酶活性试验、糖发酵和蛋白质分解。 2 结果  2.1 血清学试验 (1)179份奶牛血清经布病补体结合试验检测阳性67份,布病试管凝集试验血清凝集效价1∶1 600达到++++。(2)分离菌培养物与布病标准阳性血清进行玻片凝集试验呈阳性反应。(3)生物学分离布鲁氏菌法的接种豚鼠血清布病凝集效价1∶6 400达++++以上。 2.2 细菌分离 (1)直接接种阳性牛内脏的平板培养20天未见可疑菌落生长。(2)培养第10天时,在双份培养板中均可见有灰白色、露滴样、湿润、圆形、稍微隆起大小不等的菌落。分离菌革兰氏染色呈阴性小短杆菌,多为单个,很少成双或链状排列。 2.3 接种豚鼠 可见肝肿大、质脆,有白色点状结节;脾肿大增厚是正常的3倍、质脆,有白色点状结节;肾肿大、睾丸肿大是正常的3倍;淋巴结肿大。 2.4 生化试验 分离菌产生硫化氢持续时间为7天,变黑部分达5.4 mm;尿素酶活性试验阴性,2天都不变色。不分解精氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、木糖;氧化代谢氨基丙酸、天门酰胺、谷氨酸、核糖、半乳糖、葡萄糖、赤藓醇。 根据血清学试验、生物学分离特点及细菌的形态特征、培养特性和生理生化试验等结果确认分离菌为牛型布鲁氏菌。 3 讨论  3.1 从牛体中分离到牛型布鲁氏菌,在本地属首次,应引起有关部门的注意,及时做好防疫措施,做好奶牛的布病普查,防止人类感染布鲁氏菌病。 3.2 布鲁氏菌的初代分离培养较其他常见细菌困难,一方面是由于其对营养条件要求高,不宜满足,另一方面生长缓慢,即便有微小菌落出现,也多发育贫瘠。豚鼠对布鲁氏菌最敏感,是布鲁氏菌最好的动物模型,应用豚鼠接种分离布鲁氏菌,比用培养基分离可靠。我们将补体结合试验阳性牛的病料直接涂布含有抑制杂菌生长的抗生素的专用培养基,由于细菌含量少,出菌率低,分离不成功。采用生物学分离方法,将病料接种豚鼠作增菌培养,分离到牛型布鲁氏菌。牛型布鲁氏菌有8个生物型,该分离菌属何种生物型有待进一步鉴定和研究。 3.3 在血清学诊断方面,我们采用补体结合试验确诊,因该法主要检验igg抗体,在其体内持续存在。虽然操作复杂,但通常是初筛选出阳性畜的最后判定。而试管凝集试验虽然有良好的特异性和敏感性,其主要检查igm抗体,适用于急性病例的诊断,但通常牛本身igm正常抗体就很高,所以会出现个别假阳性。同时凝集反应无法区分是注射疫苗后产生的免疫抗体还是自然感染后产生的,免疫产生的抗体以igm占优势,而感染自然强毒布鲁氏菌后,则以igg占优势。

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